Ang IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) usa ka analogue sa β-galactosidase substrate, nga dali ra kaayong ma-inducible. Ubos sa induction sa IPTG, ang inducer mahimong moporma og complex uban sa repressor protein, aron mausab ang conformation sa repressor protein, aron dili kini mahiusa sa target gene, ug ang target gene ma-express nga episyente. Busa unsaon pagtino sa konsentrasyon sa IPTG atol sa eksperimento? Mas dako ba mas maayo?
Una, atong sabton ang prinsipyo sa IPTG induction: Ang lactose operon (elemento) sa E. coli adunay tulo ka structural genes, Z, Y, ug A, nga nag-encode sa β-galactosidase, permease, ug acetyltransferase, matag usa. Ang lacZ nag-hydrolyze sa lactose ngadto sa glucose ug galactose, o ngadto sa allo-lactose; ang lacY nagtugot sa lactose sa palibot nga moagi sa cell membrane ug mosulod sa cell; ang lacA nagbalhin sa acetyl group gikan sa acetyl-CoA ngadto sa β-galactoside, nga naglakip sa pagtangtang sa Toxic effect. Dugang pa, adunay operating sequence O, starting sequence P ug regulatory gene I. Ang I gene code usa ka repressor protein nga makagapos sa posisyon O sa operator sequence, aron ang operon (meta) mapugngan ug mapalong. Adunay usab binding site para sa catabolic gene activator protein-CAP binding site upstream sa initiating sequence P. Ang P sequence, O sequence ug CAP binding site nga magkauban naglangkob sa regulatory region sa lac operon. Ang mga coding gene sa tulo ka enzyme gi-regulate sa parehas nga regulatory region aron makab-ot ang koordinado nga ekspresyon sa mga produkto sa gene.
Kon walay lactose, ang lac operon (meta) anaa sa kahimtang sa pagpugong. Niining panahona, ang lac repressor nga gipahayag sa I sequence ubos sa kontrol sa PI promoter sequence motapot sa O sequence, nga makapugong sa RNA polymerase sa paggapos sa P sequence ug makapugong sa pagsugod sa transcription; kon adunay lactose, ang lac operon (meta) mahimong ma-induce. Niini nga operon (meta) system, ang tinuod nga inducer dili ang lactose mismo. Ang lactose mosulod sa selula ug gi-catalyze sa β-galactosidase aron mabag-o ngadto sa allolactose. Ang ulahi, isip usa ka inducer molecule, motapot sa repressor protein ug mag-usab sa protein conformation, nga mosangpot sa pagkabulag sa repressor protein gikan sa O sequence ug transcription. Ang Isopropylthiogalactoside (IPTG) adunay parehas nga epekto sa allolactose. Kini usa ka kusgan kaayo nga inducer, nga dili ma-metabolize sa bacteria ug lig-on kaayo, mao nga kini kaylap nga gigamit sa mga laboratoryo.
Unsaon pagtino sa labing maayong konsentrasyon sa IPTG? Tagda ang E. coli isip pananglitan.
Ang E. coli BL21 nga genetically engineered strain nga adunay positibo nga recombinant pGEX (CGRP/msCT) gi-inoculate sa LB liquid medium nga adunay 50μg·mL-1 Amp, ug gi-culture sa tibuok gabii sa 37°C. Ang nahisgutang culture gi-inoculate sa 10 ka botelya sa 50mL nga presko nga LB liquid medium nga adunay 50μg·mL-1 Amp sa ratio nga 1:100 para sa expansion culture, ug sa dihang ang OD600 value kay 0.6~0.8, ang IPTG gidugang sa katapusang konsentrasyon. Kini kay 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1. Human sa induction sa samang temperatura ug samang oras, 1 mL sa bacterial solution ang gikuha gikan niini, ug ang mga bacterial cell gikolekta pinaagi sa centrifugation ug gipailalom sa SDS-PAGE aron analisahon ang impluwensya sa lain-laing konsentrasyon sa IPTG sa ekspresyon sa protina, ug dayon pilia ang konsentrasyon sa IPTG nga adunay pinakadako nga ekspresyon sa protina.
Human sa mga eksperimento, makita nga ang konsentrasyon sa IPTG dili ingon ka dako kutob sa mahimo. Kini tungod kay ang IPTG adunay piho nga pagkahilo sa bakterya. Ang paglapas sa konsentrasyon makapatay usab sa selula; ug sa kinatibuk-an, nanghinaut kita nga kon mas daghan ang matunaw nga protina nga gipahayag sa selula, mas maayo, apan sa daghang mga kaso kon ang konsentrasyon sa IPTG taas kaayo, daghang gidaghanon sa inclusion ang maporma. Lawas, apan ang gidaghanon sa matunaw nga protina mikunhod. Busa, ang labing angay nga konsentrasyon sa IPTG kasagaran dili kon mas dako ang mas maayo, apan kon mas ubos ang konsentrasyon.
Ang katuyoan sa induction ug cultivation sa genetically engineered strains mao ang pagdugang sa ani sa target nga protina ug pagpakunhod sa gasto. Ang ekspresyon sa target nga gene dili lamang maapektuhan sa kaugalingong mga hinungdan sa strain ug sa ekspresyon sa plasmid, apan lakip usab sa ubang mga eksternal nga kondisyon, sama sa konsentrasyon sa inducer, temperatura sa induction ug oras sa induction. Busa, sa kinatibuk-an, sa dili pa i-express ug i-purified ang usa ka wala mailhi nga protina, labing maayo nga tun-an ang oras sa induction, temperatura ug konsentrasyon sa IPTG aron mapili ang angay nga mga kondisyon ug makuha ang labing kaayo nga mga resulta sa eksperimento.
Oras sa pag-post: Disyembre 31, 2021